營養(yǎng)師二級復(fù)習(xí)資料：抗氧化劑的測定

　　人工合成的抗氧化劑有：

　　(1)BHT2，6-二叔丁基對甲酚

　　(2)BHA叔丁基對羥基茴醚

　　(3)PG沒食子酸丙酯

　　近幾年也合成了一些新的抗氧化劑如TBHQ,DBHA等還有一些新的天然抗氧化劑，但投入使用的不多。

　?、攀宥』鶎αu基茴香醚結(jié)構(gòu)

　　特點(diǎn)：

　　1)對熱穩(wěn)定

　　2)在弱堿性中不破壞(作為焙烤食品用的抗氧化劑)

　　這種抗氧化劑在日本是禁止的

　　⑵2，6-二叔丁基對甲酚結(jié)構(gòu)

　　特點(diǎn)：(1)抗氧化性強(qiáng)于BHA;(2)毒性大于BHA

　　這種抗氧化劑在美國是禁止使用的

　?、菦]食子酸丙酯結(jié)構(gòu)

　　特點(diǎn)：(1)耐熱性強(qiáng);(2)溶于油脂，酒精等有機(jī)溶劑中

　　以上三種人工合成抗氧化劑我國都在使用，抗氧化性最強(qiáng)是混合使用，二種抗氧化劑混合使用效果最好，但要加增效劑，常用的增效劑有檸檬酸，抗敗血酸，磷酸等可以提高抗氧化劑的作用。而增效劑主要是絡(luò)合重金屬離子，使氧化性獲得新生。

　　我們從以上三種氧化劑結(jié)構(gòu)中可以看出，它們都有苯酚，所以我們要找抗氧化劑必須找酚類衍生物，我們要了解抗氧化劑的機(jī)理，它們怎樣阻止氧化?？寡趸瘎┑目寡趸瘷C(jī)理。

　　油脂氧化機(jī)制(1)鏈引發(fā);(2)鏈傳播;(3)終止

　　從RH代替脂肪或者脂肪酸

　　第一步：RH→R*.+H*

　　第二步：脂肪RH受熱或光金屬

　　第三步：R*+O2→ROO*RO2*+RH→ROOH+R*

　　第四步R*+R*→R-RR*+RO2*→RO2R

　　第二步脂肪RH受熱或光金屬催化劑等分解成不穩(wěn)定的游離基R和H,游離基當(dāng)與空氣中的O2時生成過氧化物游離基過氧化物，游離基在于脂肪RH生成氫過氧化物和游離基R，產(chǎn)生的游離基與游離基相互結(jié)合，使反應(yīng)終止，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，更多脂肪分子轉(zhuǎn)變成氫過氧化物，氫過氧化物進(jìn)一步變化，產(chǎn)生更多的游離基和穩(wěn)定的終產(chǎn)物，這些就導(dǎo)致了油脂完全的變質(zhì)的酸敗味的形成和種種的反應(yīng)生成。

　　抗氧劑的機(jī)制(以AH代表抗氧劑)

　　AH+R*→RH+A*

　　抗氧化劑的作用機(jī)制是遇到游離基后將游離基破壞，也就是說反映關(guān)鍵是把R*，RO2*作用掉，這樣就終止了鏈傳播，延長了酸敗。

　　A*+A*→A-A

　　A*+RO2*→ROOA

　　抗氧化劑--阻止，延遲脂肪自動氧化作用的物質(zhì)稱為抗氧化劑。

　　抗氧化劑的使用劑量為　　0.02%即萬分之二

　　增效機(jī)劑為抗氧化所加的1/4---1/2即0.01%

　　抗氧化劑是油溶性的，所以能引起油脂酸敗，植物油比豬油保存的時間長因?yàn)橹参镉突蚨嗷蛏俚暮幸恍┛寡趸镔|(zhì)比如生育酚等，而豬油不含有抗氧化劑所以易腐敗。

　　一、BHA測定(比色法)轉(zhuǎn)自環(huán) 球 網(wǎng)校edu24ol.com轉(zhuǎn)自環(huán) 球 網(wǎng)校edu24ol.com轉(zhuǎn)自環(huán) 球 網(wǎng)校edu24ol.com

　　1.原理用石油醚將樣品中的BHA提取出來，根據(jù)BHA在石油醚和含水乙醇項(xiàng)中分配系數(shù)不同，使其溶解72%的乙醇中，BHA與2，6-二氯醌氯亞胺的硼砂溶液生成一系列蘭色反應(yīng)，可比色測定620nm.

　　2.操作方法

　　(1)繪標(biāo)準(zhǔn)曲線編號123456

　　BHA標(biāo)液10μg/ml0.0.10.30.50.70.9

　　72%乙醇————→分別稀釋12ml←———————

　　0.01%2，6---二氯醌氯亞胺222222

　　硼砂溶液2%222222

　　靜止15分鐘

　　比色620nm繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

　　(2)樣品分析轉(zhuǎn)自環(huán) 球 網(wǎng)校edu24ol.com轉(zhuǎn)自環(huán) 球 網(wǎng)校edu24ol.com轉(zhuǎn)自環(huán) 球 網(wǎng)校edu24ol.com

　　稱魚肉2g→于50ml量筒→加無水乙醇2ml→石油醚(30-60℃)48ml→搖勻→靜止24小時→吸上溶液25ml→于125ml分液漏斗中→用72%乙醇分四次提取→合并于50ml容量瓶→加72%乙醇于刻度，若渾濁過濾→取2ml于比色管中→加72%乙醇12ml→加2，6---二氯醌氯亞胺2ml→硼砂溶液2ml→靜止15分鐘→620nm比色

　　(3)計(jì)算BHA(μg/kg)=V*V1*C/W*V2*V3

　　V--------樣品定容總體積(ml)

　　V1------------將提取液定容(ml)

　　C---------相當(dāng)于標(biāo)液濃度

　　W--------樣品的重量(g)

　　V2--------取樣品總體積(ml)

　　V3-----------測定時所用提取液的總體積

　　BHA(mg/kg)=C/W*100

　　C-------相當(dāng)于BHA的標(biāo)準(zhǔn)量(mg)轉(zhuǎn)自環(huán) 球 網(wǎng)校edu24ol.com轉(zhuǎn)自環(huán) 球 網(wǎng)校edu24ol.com轉(zhuǎn)自環(huán) 球 網(wǎng)校edu24ol.com

　　W------相當(dāng)于樣品溶液的重量(g)

　　注意事項(xiàng)：

　　染料2，6---二氯醌氯亞胺溶液見光后易變質(zhì)，儲于棕色瓶中超過6小時經(jīng)重新配制在冰箱中可保存3天，一般為用時配制。

　　例：腌魚肉2克定容50ml取出25ml提取BHA定容50ml,測定時取2ml,取溶液(相當(dāng)于5微克)代入上式計(jì)算

　　BHA(mg/kg)=V/W*V1-/V2C/V3=50ml/2g*50ml/25ml*5μg/2ml=125(mg/kg)

　　二、PG(沒食子酸丙酯)

　　沒食子酸丙酯(PG)也是常用的一種抗氧化劑，由于其合成工藝簡單，原料低廉，廣泛用于低檔產(chǎn)品中它是由沒食子酸和正丙醇酯化而成的白色或微褐色結(jié)晶性粉末，本身微苦，熔點(diǎn)145-148℃，有吸濕性，耐熱性強(qiáng)，溶于油脂，酒精等有機(jī)溶劑中。動物性油脂中抗氧化能力較強(qiáng)，遇鐵離子容易出現(xiàn)呈色反應(yīng)。

　　1.比色法原理：轉(zhuǎn)自環(huán) 球 網(wǎng)校edu24ol.com轉(zhuǎn)自環(huán) 球 網(wǎng)校edu24ol.com轉(zhuǎn)自環(huán) 球 網(wǎng)校edu24ol.com

　　PG與2，2，--聯(lián)吡啶---氯化鐵溶液生成橘紅色的發(fā)色團(tuán)，所生成的顏色深淺與PG的含量成正比關(guān)系，在530nm下比色。

　　2.操作步驟

　　a.制標(biāo)準(zhǔn)曲線

　　取10ml比色管123456

　　PG(10μg/ml)00.51.01.52.02.5

　　無水乙醇(ml)2.52.01.51.00.50

　　加水———→5.5ml——————

　　避光出加顯色劑————1ml←————

　　暗處放1小時，530nm處比色轉(zhuǎn)自環(huán) 球 網(wǎng)校edu24ol.com轉(zhuǎn)自環(huán) 球 網(wǎng)校edu24ol.com轉(zhuǎn)自環(huán) 球 網(wǎng)校edu24ol.com

　　b.樣品的處理：稱樣5g→于燒瓶中→加石油醚50ml→振動30分鐘→取上清夜25ml→于分液漏斗→用40ml水提取三次→提取液合并于50ml容量瓶→加水至刻度供測定

　　c.測定：吸2ml與比色管→加無水乙醇2.5ml→加水3.5ml→搖勻→暗處加2，2，--聯(lián)吡啶---氯化鐵溶液1ml→三氯化鐵1ml→暗處放1小時→530nm比色，同時做空白

　　d.計(jì)算：PG(mg/kg)=V1/W*V3/V2*C/V4*1000/1000

　　C---相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)PG的濃度(μg/ml)

　　V1---樣品稀釋總體積(ml)

　　V2---取總體積進(jìn)行提取(ml)

　　V3---提取后定容(ml)

　　V4---比色時提取液體積(ml)轉(zhuǎn)自環(huán) 球 網(wǎng)校edu24ol.com轉(zhuǎn)自環(huán) 球 網(wǎng)校edu24ol.com轉(zhuǎn)自環(huán) 球 網(wǎng)校edu24ol.com

　　三、BHT的測定

　　為了提高油脂的穩(wěn)定性，防止酸敗，延長保質(zhì)期,近幾年來國內(nèi)已開始在食用油中添加抗氧化劑，由于抗氧化劑BH、PG對熱穩(wěn)定性較差，而BHT的熱穩(wěn)定性較好，能適應(yīng)精練油的全過程，所以在食用油中添加抗氧化劑BHT。

　　1.比色法原理

　　油脂中的抗氧化劑BHT經(jīng)水蒸氣蒸餾法將BHT從油脂中分離出來，其蒸餾液將BHT從油脂中分離出來，其餾出物經(jīng)冷凝后溶于甲醇中，遇鄰聯(lián)二茴香胺，亞硝酸鈉試劑，生成橙紅色物質(zhì)，用氯仿萃取后的深紅色溶液在520nm處比色測E。

　　3.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

　　取6個用黑布扎的60ml分液漏斗,分別吸BHT標(biāo)準(zhǔn)溶液5μg/ml于60ml分液漏斗中→加50%甲醇溶液至25ml→加鄰聯(lián)二茴香胺溶液5ml→搖勻→加0。3%亞硝酸鈉2ml→搖1分鐘→放置10分鐘→加氯仿10ml→搖1分鐘→分層后→將下層氯仿放入黑紙包扎的10ml比色管→520nm測E→繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

　　3.樣品處理轉(zhuǎn)自環(huán) 球 網(wǎng)校edu24ol.com轉(zhuǎn)自環(huán) 球 網(wǎng)校edu24ol.com轉(zhuǎn)自環(huán) 球 網(wǎng)校edu24ol.com

　　將油脂樣5g→于500ml蒸餾瓶→加無水CaCL216克→水10ml→當(dāng)溫度達(dá)到165℃→連接好水蒸氣裝置→用50ml甲醇的容量瓶接收(最好是200ml)→收集餾液為100ml(共計(jì)150ml)→用熱甲醇(40-50℃)分次洗滌冷凝管→合并于容量瓶→用甲醇定容200ml

　　4.測定

　　吸餾液25ml→于黑布包扎的60ml分液漏斗→加鄰聯(lián)二茴香胺溶液5ml→搖勻→加0.3%亞硝酸鈉

　　2ml→搖勻1分鐘→放10分鐘→加10ml氯仿→振搖1分鐘→分層后→將氯仿液放入黑紙包扎的10ml

　　比色管→520nm下測E

　　5.計(jì)算

　　BHT(mg/kg)=V/W*C/V1

　　W----樣品重量(g)

　　V----樣品定容體積(ml)轉(zhuǎn)自環(huán) 球 網(wǎng)校edu24ol.com轉(zhuǎn)自環(huán) 球 網(wǎng)校edu24ol.com轉(zhuǎn)自環(huán) 球 網(wǎng)校edu24ol.com

　　V1------測定時所用的提取液體積(ml)

　　C-------相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)濃度(μg)

　　6.注意事項(xiàng)：

　　(1)控制蒸氣后不要太高，以免油滴帶出，影響測定結(jié)果

　　(2)蒸餾結(jié)束后，用熱的甲醇淋洗彎管以及冷凝管必須少量多次，以免沖洗不干凈，影響結(jié)果偏低。

　　(3)加入顯色劑后的反應(yīng)時間以5—7分鐘顯色到達(dá)最高峰10分鐘之內(nèi)保持恒定，然后逐漸褪色，所以必須靜置10分鐘，然后立即加氯仿萃取。

　　(4)氯仿萃取后，放于暗處1小時，如果暴露于光線中會很快褪色。

　　(5)所生成的有色物，對光具有敏感性，在暗處內(nèi)操作最好

　　四、BHA和BHT混合使用時分離與測定方法，分別顯色比色法

　　1.原理轉(zhuǎn)自環(huán) 球 網(wǎng)校edu24ol.com轉(zhuǎn)自環(huán) 球 網(wǎng)校edu24ol.com轉(zhuǎn)自環(huán) 球 網(wǎng)校edu24ol.com

　　用石油醚提取食品中的BHA和BHT。通過硅膠柱使BHA和BHT分離，BHA與2,6---二氯醌氯亞胺-

　　硼砂溶液生成蘭色。BHT與2，2，---聯(lián)吡啶---氯化鐵溶液生成橘紅色發(fā)色團(tuán)，與標(biāo)準(zhǔn)比色定量。

　　2..試劑

　?、?.01%2，6---二氯亞胺乙醇液，采用無水乙醇配置存于棕色瓶中，冰箱保存可存三天。

　?、婆鹕熬彌_溶液：取硼砂0.6g氯化鉀0.7g,NaOH0.26g加無水乙醇至500ml，過濾即可使用。

　?、?.2%а,а’-聯(lián)吡啶溶液：稱取а，а’-聯(lián)吡啶0.2g置于燒杯中，加入2ml乙醇，定100ml。

　?、?2.%FeCL3溶液：24小時后重新配置。

　?、?0%乙醇液轉(zhuǎn)自環(huán) 球 網(wǎng)校edu24ol.com轉(zhuǎn)自環(huán) 球 網(wǎng)校edu24ol.com轉(zhuǎn)自環(huán) 球 網(wǎng)校edu24ol.com

　?、适兔?0-60℃

　?、斯枘z，柱層析用，不活化。

　　⑻BHA溶液稱BHA0.050g→加少量無水乙醇溶解后→轉(zhuǎn)移100ml棕色容量瓶用無水乙醇定容→避光保存→此液為0.5mg/ml臨用時取1ml于50ml容量瓶→加無水乙醇定容→為10微克/毫升的BHA

　?、虰HT標(biāo)液：稱BHT0.1000g→少量無水乙醇溶解后→定容100ml(用無水乙醇定容)→為1.0mg/ml→取1ml定容100ml(用無水乙醇定容)→為10微克/毫升

　　3.方法(整個過程要避免光照進(jìn)行)

　　1)樣品處理

　　取磨碎樣10g→于帶塞三角瓶→加石油醚50ml→振搖20分鐘→靜止后取上層液25ml→通過硅膠柱用石油醚淋洗→收集150ml淋洗液→作為BHT檢驗(yàn)液→取出5ml于蒸發(fā)皿中自然揮干→用30%乙醇6ml洗滌濾紙→濾液于洗液合并于比色管→供BHT測定。無水乙醇淋洗以石油醚淋洗后的硅膠柱，至淋洗液為100ml，供BHT測定。

　　2)測定:轉(zhuǎn)自環(huán) 球 網(wǎng)校edu24ol.com轉(zhuǎn)自環(huán) 球 網(wǎng)校edu24ol.com轉(zhuǎn)自環(huán) 球 網(wǎng)校edu24ol.com

　　a)BHT的測定：

　　標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

　　取6個比色管編號123456

　　分別吸BHT標(biāo)液0.00.51.01.52.02.5

　　30%乙醇液———→1ml←—————————

　　加0.2%2，2-聯(lián)吡啶———→1ml←———————

　　暗室中加2，2-FeCl2———→1ml←———————

　　放置60分鐘進(jìn)行比色(波長520nm)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

　　樣品的測定：取上面BHT測定液20ml→于比色管→加30%乙醇至8ml→加0.2%2，2---聯(lián)吡啶1ml→以下按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

　　b)BHA的測定

　　標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，取6個比色管編號，123456

　　吸取BHA標(biāo)液0.00.51.01.52.02.5

　　加無水乙醇———→稀釋總體積8ml←—

　　加0.01%2，6-二氯醌氯亞胺———→1ml←—

　　硼砂緩沖溶液———→2ml←—————

　　靜止20分鐘于620nm測定消光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

　　樣品的測定：取BHA測定液4ml→于比色管→用無水乙醇稀釋至8ml→以下同標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。

　　4.計(jì)算：BHT或BHA(μg/kg)=V/W*V2/V1*C/V3*1000/1000

　　C-----測定用樣液中BHA或BHT的含量(μg)

　　V-----BHA或BHT混合時的總體積(ml)

　　V1---BHA或BHT分離時的體積(ml)轉(zhuǎn)自環(huán) 球 網(wǎng)校edu24ol.com轉(zhuǎn)自環(huán) 球 網(wǎng)校edu24ol.com轉(zhuǎn)自環(huán) 球 網(wǎng)校edu24ol.com

　　V2----BHA或BHT分離后的定容體積(ml)

　　V3----BHA或BHT分離后的測定用量(ml)

　　W-----樣品重量(g)

　　1000---將μg換算成mg

　　1000----表示單位(將g換成Kg)

　　5.注意事項(xiàng)：

　?、趴寡趸瘎┍旧頃谎趸瑯悠冯S著存放時間的延長含量會下降，所以樣品進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室應(yīng)盡快分析，避免結(jié)果偏低。轉(zhuǎn)自環(huán) 球 網(wǎng)校edu24ol.com轉(zhuǎn)自環(huán) 球 網(wǎng)校edu24ol.com轉(zhuǎn)自環(huán) 球 網(wǎng)校edu24ol.com

　?、瓶寡趸瘎〣HT穩(wěn)定性較差，易受陽光，熱的影響，操作時應(yīng)避光。

　?、怯弥鶎臃蛛x含油脂多的食品，會受到溫度的影響，室溫度低，流速緩慢，使分離效果受一些影響，最好溫度在20℃以上進(jìn)行分離。

　　五、BHA、BHT、PG混合使用時的測定方法

　　目前國內(nèi)的一些食品廠，近年來，有的將三種或其中的兩種，分別用于高油脂的食品中如餅干、巧克力、奶糖、花生米、核桃仁罐頭等BHA、BHT、PG混合使用時BHA與BHT的總量不得超過0.1g/kg，即100mg/kg,而PG不得超過50mg/kg。本法是用石油醚將食品中的三種抗氧化劑萃取出來，然后從萃取液中萃取PG，再經(jīng)硅膠柱層析將BHA,BHT分離。

　　1.原理：抗氧化劑與福林---酚試劑結(jié)合，生成一種蘭色絡(luò)合物，所生成的顏色深淺與抗氧化劑的濃度成正比，可比色定量。

　　2.試劑：a.石油醚30-60℃;b.10%碳酸鈉;c.無水乙醇;d.硅膠，柱層析用，60目;e.福林---酚試劑：稱鉬酸鈉25g→加入85%磷酸50ml，濃鹽酸100ml，水700ml，回流加熱10小時，然后加入硫酸鋰150g，水50ml，溴數(shù)滴，煮沸15分鐘，最后加水稀釋到1000ml,使用時用水稀釋三倍;f.抗氧化劑標(biāo)液：稱PG、BHA、BHT各100微克，用80%乙醇溶液溶解后定容100ml(棕色瓶)→冰箱中保存即1000微克/毫升。

　　3.操作方法轉(zhuǎn)自環(huán) 球 網(wǎng)校edu24ol.com轉(zhuǎn)自環(huán) 球 網(wǎng)校edu24ol.com轉(zhuǎn)自環(huán) 球 網(wǎng)校edu24ol.com

　　1)BHT的提純方法：取一層層析柱，按規(guī)定裝填好，先用石油醚潤濕，將上面提純的PG后分液漏斗內(nèi)剩余的石油醚層(BHT與BHA的混合液，)全部注入層析柱，用石油醚淋洗，收集150ml淋洗掖作為BHT檢查液;

　　2)BHT的提純方法：根據(jù)層析柱內(nèi)淋洗液基本流盡，再用無水乙醇淋洗，收集100ml淋洗液，供BHA檢驗(yàn)液。

　　3)顯色：吸取PG檢驗(yàn)液5ml于10ml比色管中，取BHT與BHA各5ml分別于蒸發(fā)皿中，在暗室中自然風(fēng)干，然后在PG、BHA、BHT被檢液中各加入10%碳酸鈉0.5ml混勻后，各加入0.5ml福林---酚試劑，用水稀釋到總體積6ml放2小時后顯色，在730nm下測定E.。4)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

　　準(zhǔn)確吸取不同濃度的抗氧化劑標(biāo)液于10ml比色管中。

　　10ml比色管123456

　　標(biāo)液10μg/ml0.01.02.03.04.05.0

　　10%碳酸鈉———→0.5ml←——————

　　水———→4ml←——————

　　福林---酚試劑———→0.5ml←——————

　　加水———→至總體積6ml←——————

　　放兩小時比色(730nm測定PG、BHA、BHT的E),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

　　4.計(jì)算：根據(jù)測的樣品的溶液的光密度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上分別查出對應(yīng)的PG、BHA、BHT含量(微克/毫升)。

　　抗氧化劑(mg/Kg)=V/W*V2/V1*C/V3*1000/1000

　　C-----從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的PG,BHA,BHT的濃度(微克/毫升)

　　V-----樣品定容得體積(ml)

　　V1---PG、BHA、BHT分離時的體積(ml)

　　V2---PG、BHA或BHT分離后的每種的定容體積(ml)

　　V3----顯色時取樣液得體積(ml)

　　W-----樣品重量(g)

　　1000---將μg換算成mg

　　1000----表示單位(將g換成Kg)

　　5.注意事項(xiàng)：

　?、趴寡趸瘎〣HT穩(wěn)定性較差、易受陽光、熱的影響，操作時應(yīng)避光。

　?、瓶寡趸瘎┍旧頃谎趸?，應(yīng)盡快分析，避免誤差。

　?、菍游鲋拇笮。筋w粒的范圍，吸附劑的多少，裝填的高度都對分離有影響，必須嚴(yán)格控制條件。

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