營養(yǎng)師二級復(fù)習(xí)資料：寡糖分離分析技術(shù)

　　寡糖由于單糖分子、寡糖素

　　結(jié)合位置和結(jié)合類型的不同，使得種類繁多，功能各異，寡糖的結(jié)構(gòu)與組成直接決定了其生物學(xué)功能，鑒于糖綴合物上寡糖鏈在生命過程中的重要作用，展開寡糖鏈的結(jié)構(gòu)分析是非常重要的。

　　糖類的分析方法常規(guī)的有苯酚硫酸法、二硝基水楊酸法等化學(xué)方法，但是這些方法只能測定總還原糖，不能測定各種糖的含量，且比色定量不準(zhǔn)確?；旌咸堑姆蛛x鑒定及其組成的分析方法一般采用紙色譜法、薄層色譜法及柱色譜法，能夠在糖類分離的基礎(chǔ)上對樣品中的各種糖類逐一定量分析，但這些方法存在分離效力有限和非專一性響應(yīng)的問題，隨著現(xiàn)在分析技術(shù)的進(jìn)步，幾種先進(jìn)的物理學(xué)方法己經(jīng)應(yīng)用到寡糖的分析上來，如氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)和毛細(xì)管電泳法(CE)這些方法分離能力高，方法靈敏快速。此外紅外(IR)、核磁共振(1H-NMR,13C-NMR,COSY等)、質(zhì)譜(MS)等方法也運(yùn)用到了糖類結(jié)構(gòu)分析中，使糖的分析方法有了質(zhì)的飛躍。以下簡要介紹一下這幾種方法：

　　1、氣相色譜法(GC)轉(zhuǎn)自環(huán) 球 網(wǎng)校edu24ol.com轉(zhuǎn)自環(huán) 球 網(wǎng)校edu24ol.com轉(zhuǎn)自環(huán) 球 網(wǎng)校edu24ol.com

　　氣相色譜法測定糖類始于1958年，主要用于分析多糖和寡糖的單糖組成。氣相色譜法要求供試樣品有良好的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性，而糖由于含有大量的羥基不能在高溫下直接揮發(fā)，需要將其衍生為易揮發(fā)、對熱較穩(wěn)定的物質(zhì)。多糖、寡糖可直接制備成衍生物進(jìn)行GC測定，多糖需先降解成單糖或寡糖后制成衍生物再進(jìn)行GC測定。在分析復(fù)雜樣品時，由于糖的異構(gòu)化而造成多峰現(xiàn)象，所以應(yīng)選擇適宜的衍生物制備方法，常用于糖的衍生試劑有三甲基硅烷、三氯醋酸酐等。

　　用于糖類分析的固定相從非極性、中等極性到極性都有應(yīng)用。硅烷化衍生物常用中等極性的色譜柱，酞基衍生物可采用基性較強(qiáng)的色譜柱來分離。對于復(fù)雜的多糖，由于其降解產(chǎn)物含有多個峰，且某些峰的保留時間非常接近，人們己越來越多的采用毛細(xì)管柱代替填充柱來進(jìn)行分析。

　　寡糖減肥

　　2、高效液相色譜法

　　高效液相色譜(HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC)法是一種高效率、高分辨率的分離純化手段。已經(jīng)成為常量及微量單糖和寡糖重要的分離分析方法之一。轉(zhuǎn)自環(huán) 球 網(wǎng)校edu24ol.com轉(zhuǎn)自環(huán) 球 網(wǎng)校edu24ol.com轉(zhuǎn)自環(huán) 球 網(wǎng)校edu24ol.com

　　通常采用兩種方法：一種是使用化學(xué)鍵合和氨基酸鍵合的固定相，大多數(shù)單糖、低聚糖在氨基柱上可得到滿意的分離，但是某些還原糖容易與固定相的氨基發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生希夫堿，使氨基柱的壽命縮短;另一種是離子交換樹脂作固定相的離子色譜，水或鹽為流動相。根據(jù)不同的分離機(jī)理，離子色譜可分為離子交換色譜，離子排斥色譜和離子對色譜。用于三種分離方式的柱填料骨架基本上都是苯乙烯-二乙烯基苯的共聚物。

　　一般說來，HPLC的光學(xué)檢測模式可分為直接檢測和間接檢測兩類。然而許多實(shí)際樣品中所含有的糖是微量的，且自然界存在的大多數(shù)糖類物質(zhì)基本不含有生色基團(tuán)，因此通過常規(guī)的光學(xué)檢測手段對糖類物質(zhì)進(jìn)行高靈敏度的直接檢測比較困難，如示差折光檢測(RID)的靈敏度和選擇性比較低;蒸發(fā)光散射檢測(ELSD)雖靈敏度有所提高但仍無法滿足痕量糖的分析要求。因此，人們通過衍生化將糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂凶贤馕栈蚩僧a(chǎn)生熒光的物質(zhì),然后再使用LC進(jìn)行分離分析的間接檢測方法，克服了直接檢測方法的缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了高靈敏度檢測和痕量分析。

　　3、毛細(xì)管電泳(CE)

　　毛細(xì)管電泳技術(shù)不僅是一種分離手段，還可用于寡糖的組成分析、純度鑒定和結(jié)構(gòu)歸屬，并對寡糖的酶解產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量分析，從而得到寡糖鏈的完整結(jié)構(gòu)。但除少數(shù)帶有羧基和磺酸基的糖類化合物外，絕大多數(shù)糖類化合物不帶電荷，極性很大，而且沒有發(fā)色基團(tuán)或熒光基團(tuán)，所以對于一般的高效毛細(xì)管電泳(HPCE)，可采用以下幾種方法使之產(chǎn)生更好效果：如衍生化使之帶上發(fā)色、熒光基團(tuán)或電荷;與硼酸鹽等絡(luò)合;與緩沖液中的添加劑形成包含絡(luò)合物;高pH緩沖條件下使之電離;加入表面活性劑使形成膠束等。隨著電泳技術(shù)的不斷完善，各種衍生化方法和檢測技術(shù)的出現(xiàn)，使高效毛細(xì)管電泳在糖的分離分析中應(yīng)用越來越廣泛。

　　4、紅外光譜(IR)

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　　上世紀(jì)70年代后，由于紅外光譜技術(shù)的發(fā)展以及糖化學(xué)研究深入，紅外光譜成為糖結(jié)構(gòu)研究重要手段之一。紅外光譜是有機(jī)化學(xué)和高分子化學(xué)研究中不可缺少的工具，它可為我們提供官能團(tuán)及氫鍵的相關(guān)信息。人們經(jīng)常以多糖的特征吸收峰來鑒定多糖。如840cm-1吸收峰可以判別α-糖苷鍵的存在，890cm-1吸收峰來判別β-糖苷鍵的存在。吡喃糖苷在1100～1010cm-1間應(yīng)有3個強(qiáng)吸收峰。而呋喃糖苷在相應(yīng)區(qū)域只有2個峰。

　　5、核磁共振(NMR)

　　自上世紀(jì)70年代NMR被引入多糖和寡糖結(jié)構(gòu)的研究，并且發(fā)揮著越來越重要的作用，現(xiàn)已成為多糖寡糖結(jié)構(gòu)研究的常規(guī)手段。用NMR技術(shù)研究糖鏈結(jié)構(gòu)的優(yōu)點(diǎn)是不破壞樣品。糖鏈結(jié)構(gòu)特征通過化學(xué)位移，偶合常數(shù)，積分面積，NOE及遲豫時間等參數(shù)表達(dá)。高分辨率的1H-NMR能準(zhǔn)確測定結(jié)構(gòu)表征基團(tuán)的化學(xué)位移，精度可達(dá)0.001ppm。糖鏈的各種結(jié)構(gòu)特征，均可由這些結(jié)構(gòu)表征基團(tuán)的微小變化表現(xiàn)出來。13C的天然豐度很低，使得13CNMR的靈敏度低于1H-NMR，后來出現(xiàn)的微型計(jì)算機(jī)脈沖傅立葉轉(zhuǎn)換方式使得13CNMR能夠得到清晰的光譜，使其化學(xué)位移范圍遠(yuǎn)較1H-NMR寬，達(dá)到200ppm。

　　二維NMR的出現(xiàn)使得多糖的1H-NMR和13CNMR得到了歸屬。在糖鏈的結(jié)構(gòu)分析中，綜合運(yùn)用這些技術(shù)可以獲得單糖的種類、異頭構(gòu)型、糖苷鍵位置、非糖取代基位置、單糖連接順序等一級結(jié)構(gòu)的豐富信息。

　　6、質(zhì)譜(MS)轉(zhuǎn)自環(huán) 球 網(wǎng)校edu24ol.com轉(zhuǎn)自環(huán) 球 網(wǎng)校edu24ol.com轉(zhuǎn)自環(huán) 球 網(wǎng)校edu24ol.com

　　質(zhì)譜是目前寡糖序列分析的常用方法之一。由于其靈敏度高，藥品用量少，在糖分析中得以廣泛應(yīng)用。質(zhì)譜不僅可用于提供寡糖的分子量信息而且可以確定單糖殘基間的連接順序，近年來，快原子轟擊質(zhì)譜(FAB-MS)、電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)，基質(zhì)輔助基光解吸質(zhì)譜(MALDI-MS)、基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)在測定糖的分子量和糖鏈的一級結(jié)構(gòu)方面得到廣泛的應(yīng)用。

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