2018初級藥師資格考試《相關(guān)專業(yè)知識》復(fù)習(xí)講義第九章

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　　第九章 生物技術(shù)藥物制劑

　　第一節(jié)概述

　　一、生物技術(shù)的基本概念

　　1、生物技術(shù)或稱生物工程(biotechnology)，是應(yīng)用生物體(包括微生物、動物細(xì)胞， 植物細(xì)胞)或其組成部分(細(xì)胞器和酶)，在最適條件下，生產(chǎn)有價值的產(chǎn)物或進(jìn)行有益過程的技術(shù)。

　　2、現(xiàn)代生物技術(shù)主要包括基因工程、細(xì)胞工程與酶工程、發(fā)酵工程(微生物工程)與生 化工程。

　　二、生物技術(shù)藥物的結(jié)構(gòu)特點與理化性質(zhì)

　　(一)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點 蛋白質(zhì)的組成和一般結(jié)構(gòu)(一、二、三、四級結(jié)構(gòu))(二)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)

　　1.蛋白質(zhì)的一般理化性質(zhì)：旋光性、紫外吸收、蛋白質(zhì)兩性本質(zhì)與電學(xué)性質(zhì)

　　(1)旋光性：蛋白質(zhì)分子總體旋光性由構(gòu)成氨基酸各個旋光度的總和決定，通常是右旋，它由螺旋結(jié)構(gòu)引起。蛋白質(zhì)變性，螺旋結(jié)構(gòu)松開，則其左旋性增大。

　　(2)紫外吸收：大部分蛋白質(zhì)均含有帶苯核的苯丙氨酸、酪氨酸與色氨酸，苯核在紫外280nm有最大吸收。氨基酸在紫外230nm顯示強吸收。

　　(3)蛋白質(zhì)兩性本質(zhì)與電學(xué)性質(zhì)：蛋白質(zhì)除了肽鏈N-末端有自由的氨基和C-末端有自由的羧基外，在氨基酸的側(cè)鏈上還有很多解離基團(tuán)，如賴氨酸的-氨基，谷氨酸的γ羧基等。這些基團(tuán)在一定 pH條件下都能發(fā)生解離而帶電。因此蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在不同 pH條件下蛋白質(zhì)會成為陽離子、陰離子或二性離子。

　　2.蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定性

　　(1)由于共價鍵引起的不穩(wěn)定性：水解、氧化和消旋化，此外還有蛋白質(zhì)的特有反應(yīng)，即二硫鍵的斷裂與交換

　　(2)由非共價鍵引起的不穩(wěn)定性：聚集(aggregation)、宏觀沉淀、表面吸附與蛋白質(zhì)變性

　　(三)蛋白質(zhì)類藥物的評價方法： 多種分析方法：液相色譜法、光譜法、電泳、生物活性測定與免疫測定

　　第二節(jié) 蛋白質(zhì)類藥物制劑的處方與工藝(注射劑型)

　　一、蛋白質(zhì)類藥物的一般處方組成：一類為溶液型注射劑，另一類是凍干粉注射劑

　　二、液體劑型中蛋白質(zhì)類藥物的穩(wěn)定化：①改造其結(jié)構(gòu);②加入適宜輔料 蛋白類藥物的穩(wěn)定劑：緩沖液、表面活性劑、糖和多元醇、鹽類、聚乙二醇類、大分子化合物、組氨酸、甘氨酸、谷氨酸和賴氨酸的鹽酸鹽等、金屬離子

　　1.緩沖液 因為蛋白質(zhì)的物理化學(xué)穩(wěn)定性與pH值有關(guān)，通常蛋白質(zhì)的穩(wěn)定pH值范圍很窄，應(yīng)采用適當(dāng)?shù)木彌_系統(tǒng)，以提高蛋白質(zhì)在溶液中的穩(wěn)定性。例如紅細(xì)胞生成素采用枸櫞酸鈉-枸櫞酸緩沖劑，而α-N3干擾素則用磷酸鹽緩沖系統(tǒng)，人生長激素在5mmol/L的磷酸鹽緩沖液可減少聚集。緩沖鹽類除了影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性外，其濃度對蛋白質(zhì)的溶解度與聚集均有很大影響。組織溶纖酶原激活素在最穩(wěn)定的pH條件下，藥物的溶解度不足以產(chǎn)生治療效果，因此加入帶正電荷的精氨酸以增加蛋白質(zhì)在所需pH值下的溶解度。

　　2.表面活性劑 由于離子型表面活性劑會引起蛋白質(zhì)的變性，所以在蛋白質(zhì)藥物，如α-2b干擾素、G-CSF、組織溶纖酶原激活素等制劑中均加入少量非離子表面活性劑，如吐溫80來抑制蛋白質(zhì)的聚集，其機理可能是因為表面活性劑傾向于排列在氣—液界面上，從而使蛋白質(zhì)離開界面來抑制蛋白質(zhì)的變性。

　　3.糖和多元醇 糖和多元醇屬于非特異性蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑。蔗糖、海藻糖、甘油、甘露醇、山梨醇(濃度1%~10%)最常用。糖和多元醇的穩(wěn)定作用與其濃度密切相關(guān)，不同糖和多元醇的穩(wěn)定程度取決于蛋白質(zhì)的種類。還原糖與氨基酸有相互作用，因此避免使用。

　　4.鹽類 鹽可以起到穩(wěn)定蛋白質(zhì)的作用，有時也可以破壞蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，這主要取決于鹽的種類、濃度、離子相互作用的性質(zhì)及蛋白質(zhì)的電荷。低濃度的鹽通過非特異性靜電作用提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。如SO42-、HPO42-、CHCOO-、(CH3)N+、NH4+、K+、Na+等能增加溶液的離子強度，提高疏水作用，降低疏水基團(tuán)的溶解度，使蛋白質(zhì)發(fā)生鹽析。此外它們使水分子聚集在蛋白質(zhì)周圍被優(yōu)先水化，所有這些都使蛋白質(zhì)更加緊密穩(wěn)定。經(jīng)常使用的鹽NaCl在穩(wěn)定蛋白質(zhì)中起關(guān)鍵作用，實驗表明它能提高牛血清白蛋白(BSA)的變性溫度和熱焓。

　　5.聚乙二醇類 高濃度的聚乙二醇類常作為蛋白質(zhì)的低溫保護(hù)劑和沉淀結(jié)晶劑。研究表明不同分子量的PEG作用不同，如PEG300濃度0.5%或2%可抑制重組人角化細(xì)胞生長因子(rhKGF)的聚集;PEG200、400、600和1000可穩(wěn)定BSA和溶菌酶。

　　6.大分子化合物 研究表明很多大分子化合物具有穩(wěn)定蛋白質(zhì)的作用。其機制可能是通過大分子的表面活性、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的空間隱蔽以及提高粘度來限制蛋白質(zhì)運動或通過優(yōu)先吸附于大分子以起到穩(wěn)定作用，人血清白蛋白(HAS)已在許多蛋白質(zhì)類生物技術(shù)來源的藥物制劑中作穩(wěn)定劑。近年來也有采用環(huán)糊精制成包合物來增加蛋白質(zhì)藥物的溶解度，例如用2-羥丙基--環(huán)糊精是較有前途的穩(wěn)定劑，其本身又是增溶劑可靜脈注射，可用來抑制hGH的界面變性，抑制rhKGF的聚集，穩(wěn)定白介素-2和牛胰島素等。

　　7.組氨酸、甘氨酸、谷氨酸和賴氨酸的鹽酸鹽等 可不同程度地抑制45℃ 10 mM磷酸鹽緩沖液中rhKGF的聚集。

　　8.金屬離子 一些金屬離子，如鈣、鎂、鋅與蛋白質(zhì)結(jié)合，使整個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更加緊密、結(jié)實、穩(wěn)定。不同金屬離子的穩(wěn)定作用視離子的種類、濃度不同而不同，應(yīng)通過穩(wěn)定性實驗選擇金屬離子的種類和濃度。

　　三、固體狀態(tài)蛋白質(zhì)藥物的穩(wěn)定性與工藝 (一)冷凍干燥蛋白質(zhì)藥物制劑：在蛋白質(zhì)類藥物凍干過程中常加入某些凍干保護(hù)劑來改善產(chǎn)品的外觀和穩(wěn)定性，如甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、右旋糖酐等。 (二)噴霧干燥蛋白質(zhì)藥物制劑：操作過程中損失大(特別是小規(guī)模生產(chǎn))，水分含量高。

　　第三節(jié) 蛋白質(zhì)類藥物新型給藥系統(tǒng)

　　一、新型注射(植入)給藥系統(tǒng)

　　(一)控釋微球制劑：復(fù)乳液中干燥法、低溫噴霧提取法、噴霧干燥法、超臨界萃取法

　　1.復(fù)乳液中干燥法

　　將藥物與保護(hù)劑(多為水溶性高分子聚合物)溶于水作為水相，將聚酯(如PLA、PLGA等)類高分子材料溶于二氯甲烷作為油相，兩者在一定溫度下(低于40℃)高速攪拌得W/O型初乳，冰浴冷卻至10℃以下，倒至一定濃度的PVA水溶液中，經(jīng)高速攪拌得W/O/W型復(fù)乳，一定溫度下攪拌蒸去有機溶劑固化微球(或減壓去有機溶劑)，離心水洗，真空干燥即得。該方法是制備多肽、蛋白質(zhì)等生物大分子藥物微球的常用方法，其特點為藥物包封率較高，藥物活性損失小，設(shè)備和工藝簡單，但首日突釋明顯，較難放大生產(chǎn)，目前用此法研究制備的藥物有γ干擾素、白細(xì)胞介素、亮丙瑞林、人生長激素、環(huán)孢素以及促紅細(xì)胞生長素(EPO)等。

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　　2.低溫噴霧提取法

　　將生物大分子藥物與保護(hù)劑的均勻粉末加至生物可降解性聚合物的有機溶劑(如二氯甲烷)中混合形成混懸液，將此混懸液經(jīng)噴頭霧化后噴入冰凍的乙醇溶液(該溶液可與上述溶液混溶，但聚合物不溶于此溶液)，在低溫(-70℃)狀態(tài)下，聚合物載體中的有機溶劑在乙醇中不斷擴散完全，分離微球，低溫干燥除去乙醇得粉末狀微球，該方法的特點：包封率高，微球粒徑集中，工藝穩(wěn)定，可實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，但其活性損失較復(fù)乳液中干燥法大。

　　3.噴霧干燥法

　　將生物大分子藥物及其穩(wěn)定劑的混合粉末(或水溶液)與溶有高分子聚合物的有機溶液混合形成混懸液(或乳濁液)，將此混懸液(或乳濁液)經(jīng)噴嘴霧化干燥制得微球。為了減少生物活性損失，文獻(xiàn)報道采用雙噴嘴噴霧干燥裝置進(jìn)行生物大分子藥物微球的制備，可明顯增加微球的收率，同時可減少多肽、蛋白質(zhì)類藥物的活性損失。該裝置具有兩個平行噴嘴，其中一個噴嘴噴出藥物和聚合物的混懸液(或乳濁液)，另一噴嘴同時噴出5%的甘露醇溶液，將微球包層，這樣可避免普通噴霧干燥裝置制備微球過程中易粘附器壁的缺陷。

　　4.超臨界萃取法

　　超臨界萃取技術(shù)是從20世紀(jì)80年代逐漸發(fā)展起來的一門新技術(shù)。近年來，超臨界萃取技術(shù)已在化工、冶金、食品、醫(yī)藥、生物等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。超臨界流體既具有對溶質(zhì)有較大溶解度的特點，又具有氣體易于擴散和運動的特性。更重要的是在臨界點附近，壓力和溫度微小的變化都可以引起流體密度很大的變化，并相應(yīng)地表現(xiàn)為溶解度的變化。因此，人們可以利用壓力、溫度的變化來實現(xiàn)萃取和分離的過程而成為實現(xiàn)藥物多組分分離的一種有效方法。人們將此技術(shù)應(yīng)用于微粒給藥系統(tǒng)，制備藥物的控釋聚合物微球、藥物結(jié)晶的粉末、控釋脂質(zhì)體藥物等。在制備微粒中根據(jù)聚合物及藥物的溶解特性又分為超臨界溶液快速膨脹(rapid expansion of supercritical solution，RESS)技術(shù)和氣體反溶劑(gas antisolution，GAS)技術(shù)。RESS技術(shù)的操作過程是：將固體物質(zhì)在一定的溫度和壓力下溶解在超臨界流體中形成溶液，然后將此高壓溶液從一個細(xì)小的噴嘴(一般噴嘴的內(nèi)徑為幾十微米，長約幾個毫米)噴射到常壓的空間中，由于超臨界流體在減壓的過程中變成了氣體，溶解在其中的溶質(zhì)就沉淀析出，產(chǎn)生直徑從幾百納米到幾個微米左右的顆粒。一個典型的成功例子是包埋在聚乳酸小球中的Lovastatin晶體。顆粒的構(gòu)型可以通過適當(dāng)改變壓力、溫度、溶液濃度以及噴嘴幾何形裝來調(diào)節(jié)。因此用RESS技術(shù)得到的固體顆粒都在微米級而且粒徑分布比較均勻。

　　(二)脈沖式給藥系統(tǒng)：

　　二、非注射給藥系統(tǒng)

　　(一)鼻腔給藥系統(tǒng)

　　(二)口服給藥系統(tǒng)：納米囊、胰島素腸溶軟膠囊、胰島素微球制劑、胰島素脂質(zhì)體存在四個問題：①在胃內(nèi)酸催化降解;②在胃腸道內(nèi)的酶水解;③對胃腸道粘膜的透過性差;④在肝的首過效應(yīng)。

　　(三)直腸給藥系統(tǒng)(四)口腔粘膜給藥系統(tǒng)(五)經(jīng)皮給藥系統(tǒng)(六)肺部給藥系統(tǒng)

　　第四節(jié)蛋白質(zhì)類藥物制劑的評價方法

　　 一、制劑中藥物的含量測定

　　制劑中蛋白質(zhì)類藥物的含量測定可根據(jù)處方組成確定，如紫外分光光度法和反相高效液相色譜法常用于測定溶液中蛋白質(zhì)的濃度，但必須進(jìn)行方法的適用性試驗，在處方中其他物質(zhì)不干擾藥物測定的前提下，將蛋白質(zhì)類藥物制劑溶于1.0N氫氧化鈉溶液中后采用292nm波長條件下的紫外分光光度法測定。也可采用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)、離子交換色譜(IEC)與分子排阻色譜(Size exclusion chromatography，SEC)法測定。

　　二、制劑中藥物的活性測定

　　蛋白質(zhì)類藥物制劑中藥物的活性測定是評價制劑工藝可行性的重要方面，活性測定方法有藥效學(xué)方法(如細(xì)胞病變抑制法)和放射免疫測定法。前一種方法是利用體外細(xì)胞與活性蛋白質(zhì)多肽的特異生物學(xué)反應(yīng)，通過劑量(或濃度)效應(yīng)曲線進(jìn)行定量(絕對量或比活性單位)，該方法具有結(jié)果可靠，方法重現(xiàn)性好的特點，是制訂藥物制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)最基本的方法。后一種方法是建立在蛋白質(zhì)類藥物的活性部位與抗原決定簇處在相同部位時實施的一種方法，否則活性測定會產(chǎn)生誤差。此外也可采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法測定蛋白質(zhì)類藥物活性。

　　三、制劑中藥物的體外釋藥速率測定

　　測定控緩釋制劑中蛋白質(zhì)類藥物的體外釋藥速率時考慮到藥物在溶出介質(zhì)中不穩(wěn)定，多采用測定制劑中未釋放藥物量的方法。具體方法(以微球為例)是將數(shù)個試驗組的微球(每個試驗組設(shè)置數(shù)個取樣點)置于一定量的溶出介質(zhì)中，放入37℃振動孵箱中，定時取樣離心分離測定微球中藥物含量。蛋白質(zhì)從微球中的釋放受介質(zhì)pH值、離子強度、賦形劑以及轉(zhuǎn)速、溫度等條件的影響。

　　四、制劑的穩(wěn)定性研究

　　蛋白質(zhì)類藥物制劑的穩(wěn)定性研究應(yīng)包括制劑的物理穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性兩個方面，物理穩(wěn)定性研究應(yīng)包括制劑中藥物的溶解度、釋放速率以及藥典規(guī)定的制劑常規(guī)指標(biāo)的測定，化學(xué)穩(wěn)定性包括藥物的聚集穩(wěn)定性、降解穩(wěn)定性和生物活性測定。試驗方法可參照藥物制劑穩(wěn)定性章節(jié)，檢測手段根據(jù)不同藥物的特性選擇光散射法、圓二色譜法、電泳法、分子排阻色譜法和細(xì)胞病變抑制法等進(jìn)行測定。

　　五、體內(nèi)藥動學(xué)研究

　　由于蛋白質(zhì)類藥物劑量小，體內(nèi)血藥濃度檢測的靈敏度要求高，常規(guī)體外檢測方法不能滿足體內(nèi)血藥濃度測定，此外藥物進(jìn)入體內(nèi)后很快被分解代謝，因此選擇合適的檢測方法是進(jìn)行體內(nèi)藥動學(xué)研究的關(guān)鍵。對于非靜脈給藥的控緩釋制劑的體內(nèi)藥動學(xué)試驗可考慮選擇放射標(biāo)記法測定血漿中藥物的量，該方法靈敏度高，適合多數(shù)蛋白質(zhì)類藥物體內(nèi)血藥濃度的測定。如果藥物血藥濃度與藥效學(xué)呈線性關(guān)系，也可用藥效學(xué)指標(biāo)代替血藥濃度進(jìn)行體內(nèi)吸收和藥動學(xué)研究。

　　六、刺激性及生物相容性研究

　　與其他類型藥物制劑研究一樣，刺激性及生物相容性研究是蛋白質(zhì)類藥物制劑(特別是各類注射劑)研究與開發(fā)的重要一環(huán)，根據(jù)我國SFDA(State Food and Drug Administration)藥品注冊管理辦法規(guī)定，皮膚、粘膜及各類腔道用藥需進(jìn)行局部毒性和刺激性試驗，各類注射(植入)途徑給藥劑型除進(jìn)行局部毒性和刺激性試驗外還需進(jìn)行所用輔料的生物相容性研究，以確保所用輔料的安全性。

　　思考題： 1、何謂生物技術(shù)制劑

　　2、以蛋白質(zhì)藥物制劑為例，試述其一般處方組成及如何增強其藥物穩(wěn)定性

　　小結(jié)： 1、掌握生物技術(shù)藥物制劑的概念;

　　2、熟悉蛋白質(zhì)類藥物制劑的處方與工藝及穩(wěn)定性考察。

　　3、了解蛋白質(zhì)藥物的結(jié)構(gòu)特點、理化性質(zhì)及新的給藥系統(tǒng)及評價方法。

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